পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলিতে হস্তক্ষেপের কারণগুলি

পিসিআর প্রতিক্রিয়া চলাকালীন, কিছু হস্তক্ষেপকারী কারণগুলি প্রায়শই মুখোমুখি হয়।
পিসিআরটির খুব উচ্চ সংবেদনশীলতার কারণে, দূষণকে পিসিআর ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করে এমন একটি গুরুত্বপূর্ণ কারণ হিসাবে বিবেচনা করা হয় এবং এটি মিথ্যা ইতিবাচক ফলাফল তৈরি করতে পারে।
সমানভাবে সমালোচনামূলক বিভিন্ন উত্স যা মিথ্যা-নেতিবাচক ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে। যদি পিসিআর মিশ্রণের এক বা একাধিক প্রয়োজনীয় অংশ বা প্রশস্তকরণ প্রতিক্রিয়া নিজেই বাধা বা হস্তক্ষেপ করা হয় তবে ডায়াগনস্টিক অ্যাসকে বাধা দেওয়া যেতে পারে। এটি দক্ষতা হ্রাস করতে পারে এবং এমনকি মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফলের দিকে পরিচালিত করতে পারে।
বাধা ছাড়াও, নমুনা প্রস্তুতির আগে শিপিং এবং/অথবা স্টোরেজ শর্তগুলির কারণে লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডের অখণ্ডতার ক্ষতি হতে পারে। বিশেষত, উচ্চ তাপমাত্রা বা অপর্যাপ্ত সঞ্চয়স্থান কোষ এবং নিউক্লিক অ্যাসিডের ক্ষতি হতে পারে। সেল এবং টিস্যু ফিক্সেশন এবং প্যারাফিন এম্বেডিং ডিএনএ বিভাজন এবং একটি অবিরাম সমস্যার সুপরিচিত কারণ (চিত্র 1 এবং 2 দেখুন)। এই ক্ষেত্রে, এমনকি সর্বোত্তম বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধন সাহায্য করবে না।

চিত্র 1 | ডিএনএ অখণ্ডতার উপর স্থিতিশীলতার প্রভাব
আগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিস দেখিয়েছিল যে ময়নাতদন্তের প্যারাফিন বিভাগগুলি থেকে বিচ্ছিন্ন ডিএনএর গুণমান যথেষ্ট পরিবর্তিত হয়েছিল। স্থিরকরণ পদ্ধতির উপর নির্ভর করে এক্সট্রাক্টগুলিতে বিভিন্ন গড় খণ্ডের দৈর্ঘ্যের ডিএনএ উপস্থিত ছিল। ডিএনএ কেবল তখনই সংরক্ষণ করা হয়েছিল যখন দেশীয় হিমায়িত নমুনাগুলিতে এবং বাফার নিরপেক্ষ ফর্মালিনে স্থির করা হয়েছিল। দৃ strongly ়ভাবে অ্যাসিডিক বোইন ফিক্সেটিভ বা আনহাফারযুক্ত, ফর্মিক অ্যাসিডযুক্ত ফরমালিনের ব্যবহারের ফলে ডিএনএর উল্লেখযোগ্য ক্ষতি হয়। বাকি ভগ্নাংশটি অত্যন্ত খণ্ডিত।
বাম দিকে, টুকরোগুলির দৈর্ঘ্য কিলোবেস জোড়ায় প্রকাশ করা হয় (কেবিপি)

চিত্র 2 | নিউক্লিক অ্যাসিড লক্ষ্যগুলির অখণ্ডতা হ্রাস
(ক) উভয় স্ট্র্যান্ডের একটি 3′-5 ′ ব্যবধানের ফলে লক্ষ্য ডিএনএতে বিরতি ঘটবে। ডিএনএর সংশ্লেষণ এখনও ছোট খণ্ডে ঘটবে। তবে, যদি কোনও প্রাইমার অ্যানিলিং সাইট ডিএনএ খণ্ডে অনুপস্থিত থাকে তবে কেবল লিনিয়ার পরিবর্ধন ঘটে। সবচেয়ে অনুকূল ক্ষেত্রে, টুকরোগুলি একে অপরকে পুনরায় শুরু করতে পারে তবে ফলনগুলি ছোট এবং সনাক্তকরণের স্তরের নীচে হবে।
(খ) ঘাঁটিগুলির ক্ষতি, মূলত ডেপুরেশন এবং থাইমিডিন ডাইমার গঠনের কারণে, এইচ-বন্ডের সংখ্যা হ্রাস এবং টিএম হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে। দীর্ঘায়িত উষ্ণায়নের পর্যায়ে, প্রাইমারগুলি ম্যাট্রিক্স ডিএনএ থেকে দূরে গলে যাবে এবং কম কঠোর পরিস্থিতিতে এমনকি অ্যানিয়াল করবে না।
(গ) সংলগ্ন থাইমাইন বেসগুলি একটি টিটি ডাইমার গঠন করে।
আরেকটি সাধারণ সমস্যা যা প্রায়শই আণবিক ডায়াগনস্টিকগুলিতে ঘটে তা হ'ল ফেনল-ক্লোরোফর্ম এক্সট্রাকশনের তুলনায় লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডগুলির চেয়ে কম-অনুকূল মুক্তি। চরম ক্ষেত্রে, এটি মিথ্যা নেতিবাচক সাথে যুক্ত হতে পারে। কোষের ধ্বংসাবশেষের ফুটন্ত লিসিস বা এনজাইমেটিক হজম দ্বারা অনেক সময় সংরক্ষণ করা যায় তবে এই পদ্ধতির ফলে প্রায়শই অপর্যাপ্ত নিউক্লিক অ্যাসিড রিলিজের কারণে কম পিসিআর সংবেদনশীলতা দেখা দেয়।

প্রশস্তকরণের সময় পলিমারেজ ক্রিয়াকলাপের বাধা

সাধারণভাবে, সাবপটিমাল পিসিআর ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে এমন সমস্ত কারণগুলি বর্ণনা করতে একটি ধারক ধারণা হিসাবে বাধা ব্যবহার করা হয়। কঠোরভাবে জৈব রাসায়নিক অর্থে, বাধা এনজাইম, অর্থাত্, এটি ডিএনএ পলিমেরেজ বা এর কোফ্যাক্টরের সক্রিয় সাইটের সাথে মিথস্ক্রিয়াটির মাধ্যমে সাবস্ট্রেট-পণ্য রূপান্তরকে হ্রাস বা প্রতিরোধ করে (যেমন, এমজি 2+ টিএকিউ ডিএনএ পলিমেরেজের জন্য এমজি 2+) এর ক্রিয়াকলাপের মধ্যে সীমাবদ্ধ।
নমুনা বা বিভিন্ন বাফার এবং রিএজেন্টযুক্ত এক্সট্রাক্টগুলির উপাদানগুলি সরাসরি এনজাইমকে বাধা দিতে পারে বা এর কোফ্যাক্টরগুলি (যেমন ইডিটিএ) আটকে দিতে পারে, যার ফলে পলিমারেজ নিষ্ক্রিয় করে এবং ফলস্বরূপ হ্রাস বা মিথ্যা নেতিবাচক পিসিআর ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে।
যাইহোক, প্রতিক্রিয়া উপাদান এবং লক্ষ্যযুক্ত নিউক্লিক অ্যাসিডের মধ্যে অনেকগুলি মিথস্ক্রিয়াকে 'পিসিআর ইনহিবিটারস' হিসাবেও মনোনীত করা হয়। একবার কোষের অখণ্ডতা বিচ্ছিন্নতা দ্বারা ব্যাহত হয়ে গেলে এবং নিউক্লিক অ্যাসিড প্রকাশিত হয়ে গেলে, নমুনা এবং এর আশেপাশের সমাধান এবং শক্ত পর্যায়েগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়া ঘটতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, 'স্ক্যাভেঞ্জারস' নন-কোভ্যালেন্ট ইন্টারঅ্যাকশনগুলির মাধ্যমে একক- বা ডাবল-স্ট্র্যান্ডড ডিএনএকে আবদ্ধ করতে পারে এবং অবশেষে পিসিআর প্রতিক্রিয়া জাহাজে পৌঁছানোর লক্ষ্যগুলির সংখ্যা হ্রাস করে বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধনকে হস্তক্ষেপ করতে পারে।
সাধারণভাবে, পিসিআর ইনহিবিটারগুলি বেশিরভাগ শরীরের তরল এবং ক্লিনিকাল ডায়াগনস্টিক পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত রিএজেন্টগুলিতে উপস্থিত থাকে (মূত্রের ইউরিয়া, হিমোগ্লোবিন এবং রক্তে হেপারিন), ডায়েটরি পরিপূরক (জৈব উপাদান, গ্লাইকোজেন, ফ্যাট, সিএ 2+ আয়ন) এবং পরিবেশে উপাদানগুলি (ফেনলস, ভারী ধাতু)

আরও প্রচলিত পিসিআর ইনহিবিটারগুলি ব্যাকটিরিয়া এবং ইউক্যারিওটিক কোষগুলিতে পাওয়া যায়, টার্গেট ডিএনএ, ডিএনএ-বাইন্ডিং ম্যাক্রোমোলিকুলস টিস্যু ম্যাট্রিক্স এবং ল্যাবরেটরি সরঞ্জাম যেমন গ্লাভস এবং প্লাস্টিকের মতো। এক্সট্রাকশন চলাকালীন বা তার পরে নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিশোধন হ'ল পিসিআর ইনহিবিটারগুলি অপসারণের জন্য পছন্দসই পদ্ধতি।
আজ, বিভিন্ন স্বয়ংক্রিয় নিষ্কাশন সরঞ্জাম অনেকগুলি ম্যানুয়াল প্রোটোকল প্রতিস্থাপন করতে পারে, তবে 100% পুনরুদ্ধার এবং/অথবা লক্ষ্যগুলির পরিশোধন কখনও অর্জন করা যায় নি। সম্ভাব্য ইনহিবিটারগুলি এখনও পরিশোধিত নিউক্লিক অ্যাসিডগুলিতে উপস্থিত থাকতে পারে বা ইতিমধ্যে কার্যকর হতে পারে। ইনহিবিটারগুলির প্রভাব হ্রাস করার জন্য বিভিন্ন কৌশল বিদ্যমান। উপযুক্ত পলিমারেজের পছন্দ ইনহিবিটার ক্রিয়াকলাপে উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলতে পারে। পিসিআর বাধা হ্রাস করার অন্যান্য প্রমাণিত পদ্ধতিগুলি হ'ল পলিমারেজ ঘনত্ব বাড়ানো বা বিএসএর মতো অ্যাডিটিভ প্রয়োগ করা।
অভ্যন্তরীণ প্রক্রিয়া মান নিয়ন্ত্রণ (আইপিসি) ব্যবহার করে পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলির বাধা প্রদর্শিত হতে পারে।
ইথানল, ইডিটিএ, সিইটিএবি, এলআইসিএল, জিএসএসসিএন, এসডিএস, আইসোপ্রোপানল এবং ফেনোলের মতো এক্সট্রাকশন কিটে সমস্ত রিএজেন্টস এবং অন্যান্য সমাধানগুলি অপসারণের জন্য অবশ্যই যত্ন নিতে হবে, একটি সম্পূর্ণ ধোয়ার ধাপে নিউক্লিক অ্যাসিড বিচ্ছিন্ন থেকে। তাদের ঘনত্বের উপর নির্ভর করে তারা পিসিআর সক্রিয় বা বাধা দিতে পারে।