পিসিআর বিক্রিয়ার ক্ষেত্রে হস্তক্ষেপের কারণগুলি

পিসিআর বিক্রিয়ার সময়, কিছু হস্তক্ষেপকারী কারণের সম্মুখীন হতে হয়।
পিসিআর-এর অত্যন্ত উচ্চ সংবেদনশীলতার কারণে, দূষণকে পিসিআর ফলাফলকে প্রভাবিত করার সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ কারণগুলির মধ্যে একটি হিসাবে বিবেচনা করা হয় এবং এটি মিথ্যা ইতিবাচক ফলাফল তৈরি করতে পারে।
একইভাবে গুরুত্বপূর্ণ বিভিন্ন উৎস যা মিথ্যা-নেতিবাচক ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে। যদি পিসিআর মিশ্রণের এক বা একাধিক অপরিহার্য অংশ বা পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়া নিজেই বাধাগ্রস্ত হয় বা এতে হস্তক্ষেপ করা হয়, তাহলে ডায়াগনস্টিক পরীক্ষা ব্যাহত হতে পারে। এর ফলে দক্ষতা হ্রাস পেতে পারে এবং এমনকি মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফলও আসতে পারে।
প্রতিরোধের পাশাপাশি, নমুনা প্রস্তুতির পূর্বে পরিবহন এবং/অথবা সংরক্ষণের অবস্থার কারণে লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডের অখণ্ডতা হ্রাস পেতে পারে। বিশেষ করে, উচ্চ তাপমাত্রা বা অপর্যাপ্ত সংরক্ষণের ফলে কোষ এবং নিউক্লিক অ্যাসিডের ক্ষতি হতে পারে। কোষ এবং টিস্যু স্থিরকরণ এবং প্যারাফিন এম্বেডিং ডিএনএ খণ্ডিতকরণের সুপরিচিত কারণ এবং একটি স্থায়ী সমস্যা (চিত্র 1 এবং 2 দেখুন)। এই ক্ষেত্রে, এমনকি সর্বোত্তম বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধনও সাহায্য করবে না।

চিত্র ১ | ডিএনএ অখণ্ডতার উপর অচলাবস্থার প্রভাব
অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিসে দেখা গেছে যে ময়নাতদন্তের প্যারাফিন অংশ থেকে বিচ্ছিন্ন ডিএনএর গুণমান উল্লেখযোগ্যভাবে পরিবর্তিত হয়েছে। স্থিরকরণ পদ্ধতির উপর নির্ভর করে নির্যাসগুলিতে বিভিন্ন গড় খণ্ড দৈর্ঘ্যের ডিএনএ উপস্থিত ছিল। ডিএনএ কেবল তখনই সংরক্ষণ করা হয়েছিল যখন স্থানীয় হিমায়িত নমুনা এবং বাফার করা নিরপেক্ষ ফরমালিনে স্থির করা হয়েছিল। একটি শক্তিশালী অ্যাসিডিক বোইন ফিক্সেটিভ বা আনবাফারড, ফর্মিক অ্যাসিডযুক্ত ফরমালিন ব্যবহারের ফলে ডিএনএর উল্লেখযোগ্য ক্ষতি হয়েছিল। অবশিষ্ট ভগ্নাংশটি অত্যন্ত খণ্ডিত।
বাম দিকে, টুকরোগুলির দৈর্ঘ্য কিলোবেস জোড়ায় (kbp) প্রকাশ করা হয়েছে

চিত্র ২ | নিউক্লিক অ্যাসিড লক্ষ্যবস্তুর অখণ্ডতা হ্রাস
(ক) উভয় স্ট্র্যান্ডে 3′-5′ ব্যবধানের ফলে লক্ষ্য ডিএনএতে ভাঙন দেখা দেবে। ছোট খণ্ডে ডিএনএ সংশ্লেষণ এখনও ঘটবে। তবে, যদি ডিএনএ খণ্ডে একটি প্রাইমার অ্যানিলিং সাইট অনুপস্থিত থাকে, তবে কেবল রৈখিক পরিবর্ধন ঘটে। সবচেয়ে অনুকূল ক্ষেত্রে, খণ্ডগুলি একে অপরকে পুনঃস্যাচুরেট করতে পারে, তবে ফলন ছোট এবং সনাক্তকরণ স্তরের নীচে থাকবে।
(খ) মূলত ডিপিউরিনেশন এবং থাইমিডিন ডাইমার গঠনের কারণে ক্ষার ক্ষয়, H-বন্ডের সংখ্যা হ্রাস এবং Tm হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে। দীর্ঘায়িত উষ্ণায়নের পর্যায়ে, প্রাইমারগুলি ম্যাট্রিক্স ডিএনএ থেকে গলে যাবে এবং কম কঠোর পরিস্থিতিতেও অ্যানিল হবে না।
(গ) সংলগ্ন থাইমিন ক্ষারকগুলি একটি TT ডাইমার গঠন করে।
আণবিক রোগ নির্ণয়ে প্রায়শই দেখা যায় এমন আরেকটি সাধারণ সমস্যা হল ফেনল-ক্লোরোফর্ম নিষ্কাশনের তুলনায় লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডের নির্গমন সর্বোত্তম মাত্রার চেয়ে কম। চরম ক্ষেত্রে, এটি মিথ্যা নেতিবাচকতার সাথে যুক্ত হতে পারে। কোষের ধ্বংসাবশেষ ফুটিয়ে লাইসিস বা এনজাইমেটিক হজম করে অনেক সময় সাশ্রয় করা যেতে পারে, তবে এই পদ্ধতির ফলে প্রায়শই অপর্যাপ্ত নিউক্লিক অ্যাসিড নিঃসরণের কারণে পিসিআর সংবেদনশীলতা কম থাকে।

পরিবর্ধনের সময় পলিমারেজ কার্যকলাপের বাধা

সাধারণভাবে, সাবঅপ্টিমাল পিসিআর ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে এমন সমস্ত কারণ বর্ণনা করার জন্য বাধা একটি ধারক ধারণা হিসাবে ব্যবহৃত হয়। কঠোরভাবে জৈব রাসায়নিক অর্থে, বাধা কেবলমাত্র এনজাইমের কার্যকলাপের মধ্যে সীমাবদ্ধ, অর্থাৎ, এটি ডিএনএ পলিমারেজের সক্রিয় স্থান বা এর সহ-ফ্যাক্টরের সাথে মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে সাবস্ট্রেট-পণ্য রূপান্তরকে হ্রাস করে বা বাধা দেয় (যেমন, টাক ডিএনএ পলিমারেজের জন্য Mg2+)।
নমুনার উপাদান বা বিভিন্ন বাফার এবং নির্যাস যেখানে রিএজেন্ট থাকে, সরাসরি এনজাইমকে বাধা দিতে পারে বা এর সহ-ফ্যাক্টরগুলিকে (যেমন EDTA) আটকে রাখতে পারে, যার ফলে পলিমারেজ নিষ্ক্রিয় হয়ে যায় এবং ফলস্বরূপ হ্রাস বা মিথ্যা নেতিবাচক পিসিআর ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে।
তবে, বিক্রিয়া উপাদান এবং লক্ষ্য-ধারণকারী নিউক্লিক অ্যাসিডের মধ্যে অনেক মিথস্ক্রিয়াকে 'পিসিআর ইনহিবিটর' হিসাবেও মনোনীত করা হয়। একবার বিচ্ছিন্নতার মাধ্যমে কোষের অখণ্ডতা ব্যাহত হয় এবং নিউক্লিক অ্যাসিড নির্গত হয়, তখন নমুনা এবং এর আশেপাশের দ্রবণ এবং কঠিন পর্যায়ের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া ঘটতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, 'স্ক্যাভেঞ্জার' অ-সহযোজী মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে একক- বা দ্বি-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএকে আবদ্ধ করতে পারে এবং অবশেষে পিসিআর বিক্রিয়া জাহাজে পৌঁছানো লক্ষ্যবস্তুর সংখ্যা হ্রাস করে বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধনে হস্তক্ষেপ করতে পারে।
সাধারণত, পিসিআর ইনহিবিটরগুলি বেশিরভাগ শরীরের তরল এবং ক্লিনিকাল ডায়াগনস্টিক পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত বিকারকগুলিতে (প্রস্রাবে ইউরিয়া, রক্তে হিমোগ্লোবিন এবং হেপারিন), খাদ্যতালিকাগত পরিপূরক (জৈব উপাদান, গ্লাইকোজেন, চর্বি, Ca2+ আয়ন) এবং পরিবেশের উপাদানগুলিতে (ফেনল, ভারী ধাতু) উপস্থিত থাকে।

ব্যাকটেরিয়া এবং ইউক্যারিওটিক কোষ, অ-লক্ষ্য ডিএনএ, টিস্যু ম্যাট্রিক্সের ডিএনএ-বাইন্ডিং ম্যাক্রোমোলিকিউল এবং গ্লাভস এবং প্লাস্টিকের মতো পরীক্ষাগার সরঞ্জামগুলিতে আরও প্রচলিত পিসিআর ইনহিবিটার পাওয়া যেতে পারে। নিষ্কাশনের সময় বা পরে নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিশোধন হল পিসিআর ইনহিবিটার অপসারণের জন্য পছন্দের পদ্ধতি।
আজ, বিভিন্ন স্বয়ংক্রিয় নিষ্কাশন সরঞ্জাম অনেক ম্যানুয়াল প্রোটোকল প্রতিস্থাপন করতে পারে, কিন্তু লক্ষ্যমাত্রার ১০০% পুনরুদ্ধার এবং/অথবা পরিশোধন কখনও অর্জন করা যায়নি। সম্ভাব্য ইনহিবিটরগুলি এখনও পরিশোধিত নিউক্লিক অ্যাসিডে উপস্থিত থাকতে পারে অথবা ইতিমধ্যেই কার্যকর হয়ে থাকতে পারে। ইনহিবিটরের প্রভাব কমাতে বিভিন্ন কৌশল বিদ্যমান। উপযুক্ত পলিমারেজের পছন্দ ইনহিবিটর কার্যকলাপের উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলতে পারে। পিসিআর ইনহিবিটর কমানোর অন্যান্য প্রমাণিত পদ্ধতি হল পলিমারেজ ঘনত্ব বৃদ্ধি করা বা বিএসএ-এর মতো সংযোজন প্রয়োগ করা।
অভ্যন্তরীণ প্রক্রিয়া মান নিয়ন্ত্রণ (IPC) ব্যবহারের মাধ্যমে PCR প্রতিক্রিয়ার বাধা প্রদর্শন করা যেতে পারে।
নিউক্লিক অ্যাসিড আইসোলেট থেকে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধোয়ার মাধ্যমে এক্সট্রাকশন কিটে থাকা সমস্ত রিএজেন্ট এবং অন্যান্য দ্রবণ, যেমন ইথানল, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, আইসোপ্রোপানল এবং ফেনল অপসারণের জন্য সতর্কতা অবলম্বন করা উচিত। তাদের ঘনত্বের উপর নির্ভর করে, তারা PCR সক্রিয় বা বাধা দিতে পারে।