পিসিআর প্রতিক্রিয়ায় হস্তক্ষেপের কারণ

পিসিআর প্রতিক্রিয়ার সময়, কিছু হস্তক্ষেপকারী কারণ প্রায়ই সম্মুখীন হয়।
পিসিআর-এর অত্যন্ত উচ্চ সংবেদনশীলতার কারণে, দূষণকে পিসিআর ফলাফলগুলিকে প্রভাবিত করার অন্যতম গুরুত্বপূর্ণ কারণ হিসাবে বিবেচনা করা হয় এবং এটি মিথ্যা ইতিবাচক ফলাফল তৈরি করতে পারে।
একইভাবে সমালোচনামূলক বিভিন্ন উত্স যা মিথ্যা-নেতিবাচক ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে। যদি পিসিআর মিশ্রণের এক বা একাধিক অপরিহার্য অংশ বা পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়া নিজেই বাধাগ্রস্ত হয় বা হস্তক্ষেপ করা হয় তবে ডায়াগনস্টিক অ্যাস বাধাগ্রস্ত হতে পারে। এটি কার্যকারিতা হ্রাস এবং এমনকি মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফল হতে পারে।
নিষেধাজ্ঞা ছাড়াও, নমুনা প্রস্তুতির আগে শিপিং এবং/অথবা স্টোরেজ অবস্থার কারণে লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিড অখণ্ডতা হারাতে পারে। বিশেষ করে, উচ্চ তাপমাত্রা বা অপর্যাপ্ত স্টোরেজ কোষ এবং নিউক্লিক অ্যাসিডের ক্ষতি হতে পারে। কোষ এবং টিস্যু ফিক্সেশন এবং প্যারাফিন এম্বেডিং ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশনের সুপরিচিত কারণ এবং একটি ক্রমাগত সমস্যা (চিত্র 1 এবং 2 দেখুন)। এই ক্ষেত্রে, এমনকি সর্বোত্তম বিচ্ছিন্নতা এবং পরিশোধন সাহায্য করবে না।

চিত্র 1 | ডিএনএ অখণ্ডতার উপর স্থিরকরণের প্রভাব
অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দেখিয়েছে যে ময়নাতদন্তের প্যারাফিন বিভাগ থেকে বিচ্ছিন্ন ডিএনএর গুণমান যথেষ্ট পরিবর্তিত। স্থিরকরণ পদ্ধতির উপর নির্ভর করে নির্যাসগুলিতে বিভিন্ন গড় খণ্ড দৈর্ঘ্যের ডিএনএ উপস্থিত ছিল। স্থানীয় হিমায়িত নমুনায় এবং বাফারযুক্ত নিরপেক্ষ ফরমালিনের মধ্যে ঠিক করা হলেই ডিএনএ সংরক্ষণ করা হয়েছিল। দৃঢ়ভাবে অম্লীয় বাউইন ফিক্সেটিভ বা আনবাফার, ফরমিক অ্যাসিডযুক্ত ফরমালিন ব্যবহারের ফলে ডিএনএ-এর উল্লেখযোগ্য ক্ষতি হয়। অবশিষ্ট ভগ্নাংশ অত্যন্ত খণ্ডিত.
বাম দিকে, খন্ডের দৈর্ঘ্য কিলোবেস জোড়ায় প্রকাশ করা হয় (kbp)

চিত্র 2 | নিউক্লিক অ্যাসিড লক্ষ্যমাত্রা অখণ্ডতা হারান
(a) উভয় স্ট্র্যান্ডে একটি 3′-5′ ব্যবধান লক্ষ্য ডিএনএ-তে বিচ্ছেদ ঘটাবে। ডিএনএ সংশ্লেষণ এখনও ছোট টুকরা ঘটবে. যাইহোক, যদি ডিএনএ খণ্ডে একটি প্রাইমার অ্যানিলিং সাইট অনুপস্থিত থাকে তবে শুধুমাত্র রৈখিক পরিবর্ধন ঘটে। সবচেয়ে অনুকূল ক্ষেত্রে, টুকরোগুলি একে অপরকে পুনরুদ্ধার করতে পারে, তবে ফলনগুলি ছোট এবং সনাক্তকরণের স্তরের নীচে হবে।
(b) ঘাঁটিগুলির ক্ষতি, প্রধানত ডিপুরিনেশন এবং থাইমিডিন ডাইমার গঠনের কারণে, H-বন্ডের সংখ্যা হ্রাস এবং Tm হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে। প্রসারিত উষ্ণায়ন পর্যায়ে, প্রাইমারগুলি ম্যাট্রিক্স ডিএনএ থেকে গলে যাবে এবং কম কঠোর পরিস্থিতিতেও অ্যানিল হবে না।
(c) সংলগ্ন থাইমিন ঘাঁটি একটি TT ডাইমার গঠন করে।
আরেকটি সাধারণ সমস্যা যা প্রায়শই আণবিক নির্ণয়ের ক্ষেত্রে ঘটে তা হল ফেনল-ক্লোরোফর্ম নিষ্কাশনের তুলনায় লক্ষ্য নিউক্লিক অ্যাসিডের কম-অনুকূল মুক্তি। চরম ক্ষেত্রে, এটি মিথ্যা নেতিবাচক সাথে যুক্ত হতে পারে। ফুটন্ত লাইসিস বা কোষের ধ্বংসাবশেষের এনজাইমেটিক হজম করে অনেক সময় বাঁচানো যায়, কিন্তু এই পদ্ধতির ফলে প্রায়ই অপর্যাপ্ত নিউক্লিক অ্যাসিড নিঃসরণের কারণে পিসিআর সংবেদনশীলতা কম হয়।

পরিবর্ধনের সময় পলিমারেজ কার্যকলাপের বাধা

সাধারণভাবে, নিষেধাজ্ঞা একটি ধারক ধারণা হিসাবে ব্যবহৃত হয় এমন সমস্ত কারণকে বর্ণনা করার জন্য যা সাবঅপ্টিমাল পিসিআর ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে। একটি কঠোরভাবে জৈব রাসায়নিক অর্থে, বাধা এনজাইমের কার্যকলাপের মধ্যে সীমাবদ্ধ, অর্থাৎ, এটি ডিএনএ পলিমারেজ বা এর কোফ্যাক্টরের সক্রিয় সাইট (যেমন, Taq ডিএনএ পলিমারেজের জন্য Mg2+) এর সাথে মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে সাবস্ট্রেট-পণ্যের রূপান্তর হ্রাস বা প্রতিরোধ করে।
নমুনার উপাদান বা বিভিন্ন বাফার এবং বিকারক সমন্বিত নির্যাস সরাসরি এনজাইমকে বাধা দিতে পারে বা এর কোফ্যাক্টর (যেমন EDTA) আটকাতে পারে, যার ফলে পলিমারেজ নিষ্ক্রিয় হয়ে যায় এবং ফলস্বরূপ পিসিআর ফলাফল হ্রাস বা মিথ্যা নেতিবাচক ফলাফলের দিকে পরিচালিত করে।
যাইহোক, প্রতিক্রিয়া উপাদান এবং লক্ষ্য-ধারণকারী নিউক্লিক অ্যাসিডগুলির মধ্যে অনেক মিথস্ক্রিয়াকেও 'পিসিআর ইনহিবিটরস' হিসাবে মনোনীত করা হয়। একবার কোষের অখণ্ডতা বিচ্ছিন্নতার দ্বারা ব্যাহত হয় এবং নিউক্লিক অ্যাসিড নির্গত হয়, নমুনা এবং এর পার্শ্ববর্তী দ্রবণ এবং কঠিন পর্যায়ের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া ঘটতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, 'স্ক্যাভেঞ্জাররা' অ-সহযোগী মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে একক- বা ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএ আবদ্ধ করতে পারে এবং শেষ পর্যন্ত পিসিআর প্রতিক্রিয়া জাহাজে পৌঁছানো লক্ষ্যের সংখ্যা হ্রাস করে বিচ্ছিন্নতা এবং বিশুদ্ধকরণে হস্তক্ষেপ করতে পারে।
সাধারণভাবে, পিসিআর ইনহিবিটরগুলি ক্লিনিকাল ডায়াগনস্টিক পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত বেশিরভাগ শরীরের তরল এবং রিএজেন্টগুলিতে উপস্থিত থাকে (প্রস্রাবে ইউরিয়া, হিমোগ্লোবিন এবং রক্তে হেপারিন), খাদ্যতালিকাগত পরিপূরক (জৈব উপাদান, গ্লাইকোজেন, চর্বি, Ca2+ আয়ন) এবং পরিবেশের উপাদান (ফেনলস)। , ভারী ধাতু)

ব্যাকটেরিয়া এবং ইউক্যারিওটিক কোষ, নন-টার্গেট ডিএনএ, টিস্যু ম্যাট্রিক্সের ডিএনএ-বাইন্ডিং ম্যাক্রোমলিকুলস এবং গ্লাভস এবং প্লাস্টিকের মতো ল্যাবরেটরি সরঞ্জামগুলিতে আরও প্রচলিত পিসিআর ইনহিবিটর পাওয়া যায়। নিষ্কাশনের সময় বা পরে নিউক্লিক অ্যাসিডের পরিশোধন হল পিসিআর ইনহিবিটর অপসারণের জন্য পছন্দের পদ্ধতি।
আজ, বিভিন্ন স্বয়ংক্রিয় নিষ্কাশন সরঞ্জাম অনেকগুলি ম্যানুয়াল প্রোটোকলকে প্রতিস্থাপন করতে পারে, কিন্তু 100% পুনরুদ্ধার এবং/অথবা লক্ষ্যগুলির বিশুদ্ধকরণ কখনই অর্জিত হয়নি। বিশুদ্ধ নিউক্লিক অ্যাসিডগুলিতে সম্ভাব্য ইনহিবিটরগুলি এখনও উপস্থিত থাকতে পারে বা ইতিমধ্যে কার্যকর হতে পারে। ইনহিবিটরদের প্রভাব কমাতে বিভিন্ন কৌশল বিদ্যমান। উপযুক্ত পলিমারেজের পছন্দ ইনহিবিটার কার্যকলাপের উপর উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলতে পারে। PCR বাধা কমাতে অন্যান্য প্রমাণিত পদ্ধতি হল পলিমারেজ ঘনত্ব বাড়ানো বা BSA-এর মতো সংযোজন প্রয়োগ করা।
অভ্যন্তরীণ প্রসেস কোয়ালিটি কন্ট্রোল (আইপিসি) ব্যবহার করে পিসিআর প্রতিক্রিয়ার বাধা প্রদর্শন করা যেতে পারে।
নিষ্কাশন কিটের সমস্ত রিএজেন্ট এবং অন্যান্য সমাধান যেমন ইথানল, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, আইসোপ্রোপ্যানল এবং ফেনল, একটি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধোয়ার পদক্ষেপের মাধ্যমে নিউক্লিক অ্যাসিড থেকে বিচ্ছিন্ন করার জন্য যত্ন নেওয়া আবশ্যক। তাদের ঘনত্বের উপর নির্ভর করে, তারা পিসিআর সক্রিয় বা বাধা দিতে পারে।